子科生物報(bào)道：研究人員通常通過化學(xué)方式附著“熒光基團(tuán)”來研究蛋白質(zhì)或氨基酸等生物分子，當(dāng)被激發(fā)后，在高倍顯微鏡成像下，這些熒光基團(tuán)或標(biāo)簽會(huì)呈現(xiàn)彩虹般的顏色，可以示蹤、可以幫助檢測(cè)疾病或識(shí)別遺傳條件，為研究人員提供了豐富的信息。

一次要檢測(cè)一種以上的分子——多重檢測(cè)，需要使用發(fā)出不同顏色光的其他類型的熒光基團(tuán)。但是在單分子水平上區(qū)分不同的顏色是非常困難的。這就是為什么大多數(shù)顯微鏡只能看到三到四種顏色。雖然可以使用多種方法來突破這種限制——例如重復(fù)多輪標(biāo)記成像洗脫，或者使用更多激光器的復(fù)雜設(shè)置。然而，想要用一種簡(jiǎn)單而快速的方法來看到許多顏色仍然是一個(gè)主要的挑戰(zhàn)。

芝加哥大學(xué)普利茲克分子工程學(xué)院的研究人員在今天發(fā)表在《Nature Nanotechnology》期刊上的一篇論文中概述了一種解決這一挑戰(zhàn)的新方法。Squires實(shí)驗(yàn)室概述的一項(xiàng)新技術(shù)，僅使用三種簡(jiǎn)單的化學(xué)“模塊”——Cy3，Cy5和DNA，設(shè)計(jì)出數(shù)十個(gè)“FRETfluor”標(biāo)簽，可以用來標(biāo)記更多種生物分子。

“我們的方法更簡(jiǎn)單。這是一次標(biāo)記，一次成像，”共同第一作者、芝加哥大學(xué)普利茲克分子工程博士候選人Jiachong Chu說。這意味著你可以事半功倍。目前，我們的新技術(shù)是該領(lǐng)域最好的。”

通往多重檢測(cè)的新途徑

這一研究領(lǐng)域的最終目標(biāo)——PME團(tuán)隊(duì)的論文比以往任何時(shí)候都更接近的目標(biāo)——是多重檢測(cè)。

紐鮑爾家族分子工程助理教授 Allison Squires說:“多重檢測(cè)意味著能夠在同一分析中檢測(cè)不止一種分子，你可能有10種、50種或數(shù)百種不同的蛋白質(zhì)想要識(shí)別。”“有了這項(xiàng)新技術(shù)，我們可以檢測(cè)幾十個(gè)。我相信我們可以將其擴(kuò)展到數(shù)百個(gè)?！?/p>

為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，Squires實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種創(chuàng)新的新方法，使用一種成熟的技術(shù)：熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)?rster resonance energy transfer）。FRET是一種描述能量如何在光敏分子之間傳遞的機(jī)制——一個(gè)熒光分子（供體）在被激發(fā)后，通過偶極相互作用，將其激發(fā)態(tài)能量非輻射地轉(zhuǎn)移到一個(gè)非常鄰近的分子（受體），使得受體分子激發(fā)，而供體分子回到基態(tài)。研究人員可以利用這個(gè)方法報(bào)告兩個(gè)分子何時(shí)靠近相互作用、衡量分子不同部分之間的距離。這一現(xiàn)象由德國(guó)物理學(xué)家Theodor F?rster在1948年提出。

“這個(gè)項(xiàng)目以一種新的方式利用了FRET，”第一作者之一、化學(xué)博士候選人Ayesha Ejaz說。FRET通常用于測(cè)量距離和觀察生物分子的動(dòng)力學(xué)。我們改變了供體和受體染料之間的間距，以創(chuàng)造不同的FRET效率和其他特性，我們用這些特性來識(shí)別不同的結(jié)構(gòu)?！?/p>

PME團(tuán)隊(duì)的研究中使用的27個(gè)標(biāo)簽是27個(gè)“FRETfluors”，他們使用DNA，綠色熒光基團(tuán)Cy3和紅色熒光基團(tuán)Cy5，進(jìn)行組合設(shè)計(jì)。作者首先創(chuàng)建了一系列“ABN”結(jié)構(gòu)，將非磺化的Cy3和Cy5分別整合到“A”和“B”DNA鏈中，由6≤N≤20的N堿基對(duì)分隔(圖1a顯示AB9，ABN的N可以是6-20)。下方的“橋”鏈用于對(duì)核酸靶點(diǎn)進(jìn)行序列特異性標(biāo)記或添加用于常見標(biāo)記化學(xué)的官能團(tuán)。除了ABN，作者通過修改Cy3供體的DNA序列和連接化學(xué)鍵，以及添加額外的Cy3，構(gòu)建了與ABN具有不同光物理性質(zhì)的其他FRETfluor類型(圖1b)。與ABN結(jié)構(gòu)相比，ABsk的Bsk缺少Cy3和Cy5的未配對(duì)堿基，降低了Cy3的壽命和量子效率。AcB的Ac在5 '端攜帶額外的單個(gè)Cy3，增加了亮度，降低了Cy3的凈壽命。ABin的Bin在橋鏈的3′端和B鏈的5′端之間加入了一個(gè)額外的Cy3，增加了亮度，但對(duì)Cy3的凈壽命僅略有影響。Cy3和Cy5熒光基團(tuán)的數(shù)量變化、熒光基團(tuán)之間的距離微妙變化，都影響能量傳遞效率而導(dǎo)致產(chǎn)生能夠區(qū)分的不同光物理性質(zhì)，除了發(fā)出不同顏色的光，每一種FRETfluor都表現(xiàn)出其他可調(diào)整的特性，這些特性使得研究人員可以在不到一秒的時(shí)間內(nèi)識(shí)別出極低濃度下的FRETfluor。

FRETfluor設(shè)計(jì)使用最少的構(gòu)建模塊（DNA和兩種熒光基團(tuán)），利用染料光物理的位點(diǎn)特異性可調(diào)諧性作為額外的多重維度，從而組合擴(kuò)展FRET的多重檢測(cè)能力。

Ejaz說：“通常，當(dāng)人們想要同時(shí)觀察多種組分，比如一個(gè)細(xì)胞的不同部分，他們會(huì)用不同的熒光標(biāo)簽給每個(gè)成分貼上不同的標(biāo)簽，發(fā)出特定顏色的光。但可同時(shí)用的熒光標(biāo)簽僅限于四到五種顏色，”“如果可以使用FRETfluor，那么我們可以增加可用于熒光顯微鏡的'顏色'的數(shù)量。我們目前正在測(cè)試FRETfluor在不同類型的實(shí)驗(yàn)和環(huán)境中的工作情況，這將使我們更好地了解所有的可能性?！薄斑@項(xiàng)研究的一個(gè)可能的未來方向是最終用這些FRETfluor取代普通的熒光基團(tuán)標(biāo)簽。

靈敏和簡(jiǎn)單

新的多重檢測(cè)技術(shù)的吸引力主要來自于靈敏度和簡(jiǎn)單性。“每個(gè)人都想讓自己喜歡的分析能夠多重化?！碑?dāng)時(shí)間充裕或者樣本不會(huì)變化時(shí)可以采用很多別的方法?！拔覀円鉀Q的，是當(dāng)你沒有太多時(shí)間，。。?；蛘吣阒挥泻苌僖稽c(diǎn)樣本、當(dāng)每個(gè)分子流過你的通道時(shí)你只有一次機(jī)會(huì)來識(shí)別它們時(shí)。我們可以在不到一秒的時(shí)間內(nèi)識(shí)別出低至數(shù)十飛摩爾濃度（femtomolar）的FRETfluors?！?/p>

簡(jiǎn)單也是關(guān)鍵——可以使用普通的化學(xué)試劑來構(gòu)建FRETfluors，可以用一種只需要單道激光就能讀取的技術(shù)?！拔覀冎粯?biāo)記目標(biāo)一次，只做一次讀數(shù)，”Chu說?！霸谶@種情況下，我們可以同時(shí)創(chuàng)建和使用27個(gè)不同的標(biāo)簽。”

Squires描述了現(xiàn)有技術(shù)如何與FRETfluors一起使用，以獲得更多的多重檢測(cè)的好處——“你可以引入特殊的激光激發(fā)方案，或者結(jié)合其他性質(zhì)略有不同的熒光基團(tuán)”——這將提高現(xiàn)有標(biāo)簽的讀數(shù)。Squires說，將這些多重檢測(cè)工具應(yīng)用到他們更強(qiáng)大的新技術(shù)中，可以開辟新的研究和應(yīng)用領(lǐng)域。“成像和基于流動(dòng)的生物醫(yī)學(xué)分析的這些改進(jìn)將使下一代創(chuàng)新成為可能?！?/p>