子科生物報道：在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，飼料引起腸黏膜慢性炎癥的情況尤為常見，同時腸黏膜免疫屏障也經(jīng)常是水產(chǎn)病源（如病毒、細菌等）入侵的首當其沖的位置。因而，對于魚類腸炎的研究已成為最近水產(chǎn)疾病的基礎(chǔ)研究熱點。 

　　目前，斑馬魚已成為腸粘膜免疫研究的常見模式動物，應用于疾病建模以及藥物篩選。中國科學院水生生物研究所魚類功能基因組學學科組科研人員利用斑馬魚開發(fā)了一整套腸炎研究體系，包括幼魚的固有免疫階段和適應性免疫階段的腸黏膜免疫細胞成像分析方法[1, 2]，以及成魚的豆粕誘導腸炎（SBMIE）的病理和多組學分析方法?；诎唏R魚食源性腸炎模型，進行了一系列水產(chǎn)藥物開發(fā)[3,4,5]。但是，關(guān)于藥物在魚體內(nèi)起效的免疫機理的深入解析，還需要對成魚腸粘膜免疫在細胞水平上的研究進行方法上的突破。 

　　近日，該團隊創(chuàng)新了斑馬魚腸黏膜免疫細胞懸液的制備操作方法，開發(fā)了一套快速簡單的操作方法，用于制備來自腸粘膜的免疫細胞懸液。通過反復吹打，可將腸絨毛肌層以上部分的免疫細胞分離出來（圖1）。與經(jīng)濟魚常用的網(wǎng)搓法相比，吹打法對斑馬魚黏膜組織細胞活性的損失較小。再采用流式細胞術(shù)，結(jié)合熒光標記免疫細胞的分門策略，可精確分離斑馬魚腸黏膜免疫細胞群中的各種免疫細胞類群，包括中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等。本方法是對于斑馬魚腸黏膜炎癥模型的有效技術(shù)補充，可更好地在細胞水平探究斑馬魚腸黏膜免疫的機理。 

圖1 粘膜免疫細胞懸液的制備操作圖解

　　在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚腸黏膜細胞懸液細胞，發(fā)現(xiàn)結(jié)團率較低，多數(shù)粒徑在10μm左右。采用免疫細胞熒光標記的斑馬魚品系來分離，發(fā)現(xiàn)AO/PI染色后，與傳統(tǒng)的網(wǎng)搓法相比，流式細胞術(shù)檢測所得細胞活性大幅提高，細胞基本無粘連，熒光表達和細胞形態(tài)均良好（圖2）。對腸組織和處理后剩余部分進行切片觀察發(fā)現(xiàn)，處理后僅剩肌層與漿膜層，而上皮層與固有層已不可見，暗示其中細胞已被制為懸液。而qPCR和轉(zhuǎn)錄組分析均能進一步證明分離細胞的組成。結(jié)果表明分離細胞組的免疫細胞標記基因表達量顯著高于腸組織本身，而MUC基因表達熱圖也表明在分離細胞組優(yōu)勢表達的為內(nèi)層黏蛋白基因；KEGG富集分析也在分離細胞組中發(fā)現(xiàn)大量免疫相關(guān)通路。 

圖2 熒光標記的腸黏膜免疫細胞的流式細胞術(shù)分析表明本方法在細胞活性和得率上具有優(yōu)勢

　　進一步，對目前的吹打法制備的細胞懸液及其流式細胞術(shù)進行了應用。在對各類型的免疫細胞（熒光標記）進行了流式細胞術(shù)分析，與網(wǎng)搓法比，吹打法能顯著提高腸黏膜來源的細胞懸液中免疫細胞的得率；而對其他免疫組織（外周血、頭腎、脾臟、肝臟）來源的細胞懸液的對比分析，發(fā)現(xiàn)腸免疫細胞比例符合魚類免疫細胞的正常分布比例。通過吹打法在斑馬魚SBMIE腸炎模型中的應用分析，表明該方法能夠準確反映腸炎相關(guān)免疫細胞比例變化（圖3）。 

　　因此，目前在斑馬魚中開發(fā)的腸黏膜免疫細胞懸液制備及分離分析的方法，提供了研究模式魚類的腸黏膜免疫細胞的實用技術(shù)。本方法可應用于水產(chǎn)腸炎病理研究，即病源或者食源中的抗原、抗營養(yǎng)因子等引起的黏膜屏障功能失調(diào)，乃至經(jīng)腸吸收的飼料添加的功能成分或替抗藥物（如功能性植物成分或中草藥）的抗病效果評價，可對其在維持腸粘膜免疫穩(wěn)態(tài)中的作用進行細胞水平的機制解析。另一方面，對于醫(yī)學基礎(chǔ)研究中的結(jié)腸炎斑馬魚模型來說，化學物質(zhì)DSS、TNBS等誘導的克羅恩?。–rohn’s Disease, CD）、潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis, UC）的模型，本方法也適用，可提供在細胞水平上的研究手段支持。 

圖3 本方法在斑馬魚SBMIE模型中對免疫細胞的分析應用

　　本研究是在吳南副研究員主持的中國科學院江西產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與育成中心科技支撐產(chǎn)業(yè)發(fā)展計劃項目“水產(chǎn)替抗功能植物篩選與漁用技術(shù)研發(fā)”（ZKYJXZXCY-202210）、以及國家自然科學基金面上項目（31872592）的共同資助下，由碩士研究生趙旭陽、劉宇航、謝家元等人共同完成，夏曉勤研究員和吳南副研究員為共同通訊作者。相關(guān)研究成果在Frontiers in Immunology雜志發(fā)表（DOI: 10.3389/fimmu.2023.1193977），題為《The manipulation of cells suspension from zebrafish intestinal mucosa contributes to understanding enteritis》，收錄于魚類黏膜免疫研究的熱點專題“Mucosal Barrier in Teleost Fish: Physical Biochemical and Immune Nature”。 

　　參考文獻： 

　　1. 黎明，謝家元，李曉敏，王銳，單俊瑋，趙旭陽，程瑩寅，張婉婷，吳南*，夏曉勤*. 斑馬魚食源性腸炎模型及其免疫細胞成像分析方法的建立. 水生生物學報，2022，46（2），1-12. 

　　2. M Li, X Zhao, J Xie, X Tong, J Shan, M Shi, G Wang, W Ye, Y Liu, BH Unger, Y Cheng, W Zhang, N Wu* and X-Q Xia*. Dietary Inclusion of Seabuckthorn (Hippophae rhamnoides) Mitigates Foodborne Enteritis in Zebrafish Through the Gut-Liver Immune Axis, Frontiers in Physiology, 2022, 13, 831226. 

　　3. J Xie, M Li, W Ye, J Shan, X Zhao, Y Duan, Y Liu, BH Unger, Y Cheng, W Zhang, N Wu* and X-Q Xia*. Sinomenine hydrochloride ameliorates fish foodborne enteritis via α7nAchR mediated anti-inflammatory effect whilst altering microbiota composition, Frontiers in Immunology, 2021, 12, 766845. 

　　4. N Wu*, X Xu, B Wang, XM Li, YY Cheng, M Li, XQ Xia and YA Zhang. Anti-foodborne enteritis effect of galantamine potentially via acetylcholine anti-inflammatory pathway in fish. Fish and Shellfish Immunology, 2019, 97, 204-215.